固定钛离子亲和色谱材料的制备

时间:2018-12-21 08:21:08 来源:涌金新闻网 作者:匿名



在先前的研究中,磷酸化的壳聚糖和纤维素用作合成MAC材料的基质材料,然后将铁离子固定为用于螯合酸化多肽的官能团。

然而,由于壳聚糖和纤维素不能溶解在水溶液中,如果它在水相中被磷酸化,则改性只能在表面上发生,并且反应是非均相反应。

众所周知,聚乙烯醇是高度水溶性的生物相容性高分子物质,具有抗非特异性吸附特性,因此从水溶性的观点出发,非常适合作为怜酸化多肽的富集材料。与怜酸的均相反应可以在水溶液中进行。

另外,由于聚乙烯醇和磷酸反应形成凝胶状物质,因此产物具有大的比表面积,这为随后的钛离子固定提供了更多的位置。

1主要试剂和材料

未标记的试剂是分析级的,未经处理即可使用。

除了在玉米培养过程中使用蒸汽水和使用高纯度水测定蛋白质浓度外,其他实验用水是去离子水。

2玉米种植和盐处理

农大108是一种在中国北方广泛使用的玉米品种。在本研究中使用溶液培养物在温室中培养。

在培养中,参考了Ozturk(2002)的研究论文,该论文与Hoagland的营养液一起培养,并建立了三个独立的盐处理重复和三个独立的对照重复。将这些烧瓶随机排列在培养物中。用盐处理浓度为150mM Naa处理室。

具体培养过程如下:: 1)用10%H 2 O 2对玉米种子进行消毒30 min; 2)洗涤去离子水数次以除去多余的H: A; 3)将种子浸泡在饱和CaSOi溶液中6小时,连续通风;用去离子水浸泡两层滤纸,将玉米种子放在两层滤纸的中间,避光,在20℃下孵育7天; 5)将发芽的种子转移到半营养液中(所有成分都是正常的)在Hoagland营养液的2.5L陶瓷培养罐中,通气培养2天; 6)将种子转移到含有全营养液的2.5L陶瓷培养物中,通气培养6天; 7)用含有150mM NaCl的Hogland培养基处理一半培养的玉米,24小时后与对照样品一起收获; 8)将收获的玉米叶用吸水纸吸干,在液氮中冷冻并在-80℃下储存。3蛋白质样品制备

3.1从玉米叶组织中提取蛋白质(苯甲酸法)

用苯法从玉米叶中提取组织蛋白的具体方法如下:: 1)在液氮保护下将-80℃保存的玉米叶研磨成细粉; 2)冷冻50mL离心管,用于冰上;将2g磨碎的玉米叶加入离心管中; 4)向上述每个离心管中加入5mL苯蛋白提取物,提取物组合物为1%PVPP,0.7M鹿糖,0.1MKC1,0.5M Tris-HCl(pH7.5),50mM EDTA,1mM PMSF。 ,2%(v/v)P-巯基乙醇,旋转15分钟; 5)在4℃下向每个样品中加入5mL饱和的Tris,干燥旋转30分钟; 6)在4℃,12000g离心40min,将相转移到相应的新管中; 7)向含有苯酚相的各管中加入5倍体积的乙酸作为饱和甲醇溶液,-2(rC过夜; 8)将上述溶液在4℃,12000g离心40分钟,弃去澄清溶液; 9)用预先冷却的丙酮溶液洗涤三次离心得到的沉淀物; 10)在4°C下用高纯度氮气吹扫沉淀物干燥,保存在-20°C进行消化。

3.2从玉米叶组织中提取蛋白质(PEG位点法)

首先,在液氮保护下,将保存在-80℃的玉米叶子研磨成细粉,然后用PEG柱法逐步提取组织中的蛋白质。最后,苯甲酸法用于获得PEG饱和度方法。进一步提取产物。

具体方法如下:: 1)冷冻50 mL离心管,冰上使用; 2)将2g磨碎的玉米叶加入离心管中; 3)向每个含有玉米叶的管中加入6mL。冷萃取缓冲液,萃取缓冲液组分0.5 MTris-HCl(pH 8.3),2%NP-40,20mM MgCl 2,2%PVPP,1mM PMSF,2%(v/v)对硫烷基乙醇,25mM NaF, 1mM NajVC,1mM p-GPDSH和1mM SPTDH; 4)在4℃下将混合物均化15分钟; 5)在4℃下离心15分钟,12000g弃去沉淀物; 6)将PEG加入上清液中,加入PEG至终浓度为5%(w/v); 7)离心15分钟,4℃离心,3200g离心20分钟,收集沉淀物作为第一步提取物(P1),将上清液转移到新的离心管中; 8)将PEG加入上清液中,使溶液中PEG的最终浓度为10%(Wv); 9)经过15分钟的调解,4'>将3200g离心20分钟,收集沉淀物作为第二步提取物(P2),将上清液转移到新的离心管中; 10)将PEG加入上清液中,使溶液中的PEG终浓度。 15%(w/v); 11)中断15分钟后,在3℃,3200g离心20分钟,收集沉淀物作为第三步提取物(P3),并将上清液转移到新的离心管中。 12)将PEG加入上清液中,使溶液中PEG的最终浓度为20%(w/v); 13)离心15分钟,3℃离心,3200g离心20分钟,收集沉淀物作为第四步提取物(P4),将上清液转移到新的离心管中; M)将上清液与5体积的饱和乙酸铵的甲醇溶液混合,循环15分钟,-20℃过夜;将前一步骤中的混合物在4℃和12000g下离心20分钟,弃去上清液。得到的沉淀物是第五步提取物(P5); 16)添加到P1,P2,P3,P4和P5中的每一个。 ImL苯并呋喃蛋白提取物,以下步骤与苯粉法相同。

3.3玉米叶组织蛋白质的消化

称重80mg玉米叶组织蛋白质提取物并溶解在900mL裂解物中。裂解物组成如下:: 7M尿素,2M硫脲,4%CHAPS。 50mM NH 4 HCO 3>

将10 ^ L蛋白酶抑制剂(一种蛋白质抑制剂片剂溶解在1mL去离子水中),干燥纺丝均质化后,向溶液中加入20μlLDTT(1M),100μLLA(1M),调节后,IH为在黑暗中养殖。

培养后,通过12,000g离心30分钟除去不溶物,从上清液中取出20ML,转移到新的离心管中测定蛋白质含量。

同时,用50niMNH4HCO3溶液将剩余的上清液稀释10倍,加入适量的胰蛋白酶(胰蛋白酶/蛋白质=1/40,W/W),酶促消化蛋白质,避免光照。 37°C后。培养16小时后,将酶分解的多肽溶液真空干燥并储存在-20℃。通过IMAC分离并富集磷酸化的多肽。3.4 m叶组织中蛋白质浓度的测定

通过与酶标仪结合的2-D蛋白质定量试剂盒测定蛋白质浓度。具体步骤如下:: 1)在1.5mL离心管中取7.5μL待测蛋白质裂解物,每个样品需要重复两次。 2)绘制标准曲线,标准BSA溶液(由2-D蛋白质定量试剂盒提供的标准蛋白质)为0 nL,2.5 nL,5 fiL,7.5 ^ iL,10个团队,12.5 iiU 3)根据2-D蛋白质定量试剂盒处理样品和标准样品的说明; 4)用于测量的酶标仪,仪器检测波长为480 nm; 5)输出结果。

3.5标准怜酸化肽样品的制备

称重Imga-Bing蛋白(标准怜酸化蛋白),将其溶解于1 mL NHjHCOj(50 mM)溶液中,加入适当的胰蛋白酶(胰蛋白酶/蛋白质=1/40,w/w),并保护样品免受光照。在℃下温育16小时后,获得X-酪蛋白多肽的混合物。

分配培养溶液,2.5nL /管,真空冷冻干燥,并储存在-20℃直至使用。

4 Ti-IMAC材料的合成

将60mL HyPO 4置于三颈圆底烧瓶中,机械搅拌并缓慢升温。称量13.2g PVA并缓慢加入反应烧瓶中。将温度升至90℃并开始反应。 8小时后,停止反应,得到凝胶状聚合物。 。

在冷冻液氮之后,研磨凝胶状聚合物,然后用去离子水洗涤数次,直到在聚合物洗涤溶液中没有检测到磷酸,并且通过滴加硫酸钛溶液观察洗涤液中的可惜酸。是否存在沉淀物似乎在判断。

将清洁过的聚合物在80℃真空烘箱中干燥24小时。制备100mM Ti(S(Xt)2溶液,将干燥的聚合物加入Ti(S(XO 2溶液,在室温下搅拌10小时,金属钛离子)即即将其固定在聚合物材料上。

过滤后,用去离子水洗涤该物质,并在40℃下真空干燥24小时,得到Ti4-IMAC。引用:

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[关键词]材料采集,样品制备,蛋白质提取,奥克官方网站

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